作者：医学镜界

Sander P, Harland N, Serna-Higuita LM, Bonzheim I, Bösmüller H, Stenzl A, Fend F. Multiparametric Classification of Non-Muscle Invasive Papillary Urothelial Neoplasms: Combining Morphological, Phenotypical, and Molecular Features for Improved Risk Stratification. Int J Mol Sci. 2022 Jul 23;23(15):8133. doi: 10.3390/ijms23158133. PMID: 35897708; PMCID: PMC9330009.

一、简介

膀胱癌是世界上最常见的癌症之一，每年约有 550,000 例 [ 1 ]。截至诊断时，大约 75% 的膀胱癌是低级别、非肌层浸润性乳头状肿瘤，被称为非肌层浸润性膀胱癌 (NMIBC) [2 ]。NMIBC 包括侵犯固有层和结缔组织的乳头状肿瘤，按照 TNM 分类分为 T1、Ta 和 Tis。根据其形态特征，这些肿瘤可进一步分为低级别和高级肿瘤。低级别肿瘤 Ta 和 T1 在 5 年随访中经常复发 (31–78%) 但很少进展为浸润 (少于 1% 和 45%)，因此预后良好 [3 , 4 , 5 ]。另一方面，高级别乳头状肿瘤可能发展为肌层浸润性膀胱癌 (MIBC)，后者通常会发展为转移 [ 6]]. 因此，在尿路上皮癌的治疗中，病理分级的确定旨在将肿瘤分为不同的预后组，以评估治疗结果并优化患者管理。针对膀胱非侵入性乳头状病变的病理分级提出了几种分级系统 [ 7 ]。1973 年的 WHO 分类将膀胱尿路上皮癌分为 G1、G2 和 G3 级；然而，由于这在定义 G2 肿瘤方面存在一些局限性，因此它被 2004/2016 WHO 分类系统所取代 [ 8]. 该系统如今广泛用于对不同组织学亚组中的非肌肉浸润性尿路上皮瘤形成进行强有力的分类，包括低度恶性潜能的乳头状尿路上皮瘤，称为 PUN-LMP、低级别乳头状非浸润性尿路上皮癌 (LG-PUC) 和高级别乳头状非浸润性癌 (HG-PUC)。然而，该方案也给解释带来了一些困难，导致观察者间的变异性相对较高，在 PUN-LMP 病例中为 12-39%，在 LG-PUC 中为 21-63%，在 HG-PUC 中为 18-56% .

近年来随着新一代测序技术的出现，膀胱癌的诊断不仅关注形态学，还关注分子特征。在 UROMOL 研究中，NMIBC 肿瘤根据其转录特征分为三类，显示出细胞周期基因和分化标志物表达的差异 [9 ]。此外，隆德大学小组根据可激活的靶向和转录因子确定了五个不同的实体，包括 Uro A、基因组不稳定、浸润性 SCC 样和 Uro B 亚型 [10]，它们大致对应于基底和管腔北卡罗来纳大学分类中描述的亚组 [ 11]. 这些分子亚群已变得非常重要，因为它们与临床预后直接相关，但尚未进入临床实践 。

NMBIC 患者的常规治疗是经尿道膀胱肿瘤切除术 (TURBT)，联合或不联合卡介苗 (BCG) 膀胱内治疗以降低进展风险。然而，尽管 BCG 治疗有效，60% 的患者可能在 12 个月后复发，20% 的患者可能进展为 MIBC。不成功的 BCG 治疗患者需要根治性膀胱切除术或化学疗法和放射疗法，这两者都与相当大的发病率相关。因此，需要其他疗法，如免疫检查点抑制剂和基于其分子谱的疗法来改善膀胱癌的发病率 。在这项研究中，我们从组织病理学、免疫表型和突变状态等三个不同层面研究了非侵入性 PUC 的特征，旨在进行准确和稳健的分类。该分类包括使用形态学特征、包括 CK20、p16、p21、p53、MIB-1、有丝分裂标记物 p-HH3 和 FGFR3（成纤维细胞生长因子受体）的免疫组织化学组，以及与复发和复发相关基因的靶向突变分析。预后，包括FGFR3、TP53、PTEN、PIK3CA、ERCC2和STAG2。

2. 结果

2.1. 队列描述

本研究共纳入 45 例非浸润性尿路上皮乳头状瘤变患者，最初分类为 pTa，组织质量良好，适合进一步分析。临床信息总结于表格1. 男女比例为 2.75:1，中位年龄为 75 岁（范围 50-95 岁）。根据 TNM 分类，39/45 (86.6%) 患者被归类为纯 pTa，而 6/45 (13.3%) 患者在另一个部位有 pT1 病变。19 例 (42.2%) 在膀胱的两个或更多区域显示多个肿瘤定位，而 26 例显示单个病变。不到一半的患者复发 (48.4%)，只有 52.6% 的患者在两年的随访中没有复发。根据 44 名患者的现有临床数据，只有 25/44 (56.8%) 患者接受了立即治疗，13/44 (29.5%) 患者接受了立即 MMC 滴注。所有组织学 HC-PUC 诊断的患者 (12/44, 27.3%) 均接受了再 TUR-BT 治疗，19 名 (19/44, 43.2%) 患者仅接受医学观察但未给予治疗。表格1).

表格1非浸润性尿路上皮乳头状瘤变病例的临床特征。

在单独的窗口中打开

MMC：丝裂霉素C；BCG，卡介苗（BCG）；TUR-BT，经尿道膀胱肿瘤切除术。* 百分比是针对 44 名患者计算的，因为 1 例患者的一些临床数据不可用。

2.2. 组织学分类

对原始诊断和原始诊断报告 (ODR) 不知情的三位病理学家的诊断一致性数据报告于表 2. PUN-LMP 诊断的观察者间变异性适中 (57%)，LG-PUC 病例良好 (67%)，HG-PUC 病例极好 (87%)。在比较 PUN-LMP 和 LG-PUC 诊断时发现了最显着的观察者间变异性，Fleiss Kappa 指数相当低，为 0.43 ( p= <0.001)，95% 置信区间在 0.398–0.635 之间。当至少有两名独立观察员达成一致意见时，就建立了共识诊断。根据共识，只有 18% 的病例被归类为 PUN-LMP，但一半（51.1%）的患者属于 LG-PUC 类别，33.3% 的患者被归类为 HG-PUC。在后续行动中，如预期的那样，在 HG-PUC 病例中观察到更高的复发率。与 LG 和 HG-PUC 的 23 个月和 5 个月相比，PUN-LMP 的病例显示出更高的中位无复发（34 个月）。两年复发分析显示，与 LG-PUC (42.7%) 和 PUN-LMP (33.3%) 相比，HG-PUC 的复发率 (79.5%) 更高（p = 0.14，图1). 根据补充表 S2中的共识诊断描述基线临床特征和随访。

图1组织学分级和无复发生存。

（一）。代表性组织学图像显示不同肿瘤等级（PUN-LMP、LG-PUC 和 HG-PUC）的主要特征。（乙）。通过共识诊断比较肿瘤分级的无复发生存期的 Kaplan-Meier 分析。（丙）。比较 TNM 分类和肿瘤分级的无复发生存期的 Kaplan-Meier 分析。PUN-LMP，低度恶性潜能的乳头状尿路上皮瘤；LG-PUC，低级别尿路上皮乳头状癌；HG-PUC，高级别尿路上皮乳头状癌。

表 2WHO 2004/2016 组织学类别之间的观察者间变异性。

PUN-LMP，低度恶性潜能的乳头状尿路上皮瘤；LG-PUC，低级别尿路上皮乳头状癌；HG-PUC，高级别尿路上皮乳头状癌；P 1、2、3，病理学家 1、2 和 3。** p值 < 0.001 Fleiss Kappa。

2.3. 免疫组化特征及与肿瘤分级的相关性

Spearman 的组织评分等级相关矩阵在诊断类别之间没有正相关，除了增殖指数，它与 p-HH3 染色评估的有丝分裂计数呈正相关（图 2). CK20、p53 和增殖率 (MIB-1) 是识别具有较高组织学分级和不良后果的病例的合适工具。这三个标志物在 LG-PUC 和 HG-PUC 病例中显示出比 PUN-LMP 病例更高的组织评分 ( p < 0.05) (表3和图 2). 肿瘤抑制因子 p53 在三个亚组中显示异质染色，但与 PUN-LMP 相比，在分类为 LG-PUC 和 HG-PUC 的病例中表现出更高的表达 ( p = 0.06)。此外，与 LG- 或 HG-PUC 病例相比，归类为 PUN-LMP 的病例显示 CK20、p53 染色较弱，p-HH3 评估的增殖和有丝分裂率较低（p< 0.001)。与 HG-PUC 组相比，LG-PUC 病例显示出相似的 CK20 和 p53 组织评分。相比之下，HG-PUC 病例的增殖率 (MIB-1) 和有丝分裂计数得分较高。一些 PUN-LMP 和 LG-PUC 病例显示有丝分裂计数较高，但在这些病例中，与 HG-PUC 相比，有丝分裂仅限于基底层。细胞周期蛋白 p21 和 p16 在病例中染色不均匀，与组织学分级无相关性。总共有 28/37 (75.7%) 个病例显示所有病例均缺乏 FGFR3 染色，但分类为 LG-PUC 的 6 个病例 (6/20, 30%) 显示 FGFR3 过表达。一般而言，只有 16/25 (64%) 的病例显示缺乏与其突变状态相关的 FGFR3 表达，因为一些突变可能导致非功能性蛋白质。

图 2免疫组织化学特征。

（一）。斯皮尔曼等级相关矩阵和免疫组织化学变量的相关意义。值显示 Spearman 排名结果；蓝色表示正相关，红色表示负相关。（乙）。小提琴图比较了非侵入性 PUC 类别中用 p-HH3 染色的 10 个高倍视野 (HPF) 中的有丝分裂计数。（丙）。免疫组织化学标记物的不同组织评分的小提琴图，表示非侵入性 PUC 实体。对于统计分析，使用未配对t检验，ns= 不显着，* p < 0.05，** p < 0.01，**** p < 0.0001。

表3根据组织学分级的病例的组织评分。

组织评分中位数 (p25–p75)；PUN-LMP，低度恶性潜能的乳头状尿路上皮瘤；LG-PUC，低级别尿路上皮乳头状癌；HG-PUC，高级别尿路上皮乳头状癌。* 10 个高倍视野 (HPF) 中的有丝分裂数。

2.4. 突变景观

总共有 37 个案例使用靶向 NGS 进行了分析。测序的平均读取深度为 6820 次读取 (1141–23,628)。突变的分布描述于图 3补充表 S1中总结了详细信息。总共鉴定出 80 个突变，66/80 个错义点突变 (82.5%)，9 个无义突变 (11.25%) 和 5 个移码突变 (6.25%)。SIFT、PolyPhen-2 和 CADD 的分析预测了对所有报告的错义突变的破坏性影响。所有基因突变的变异等位基因频率 (VAF) 范围为 3% 至 93%（平均 34%）。

图 3

（一）。每个诊断类别的突变和免疫组织化学结果概述。（乙）。两个和三个子组（分别为右侧和左侧）的聚类分析。（丙）。使用聚类图中显示的聚类分析的无复发生存的 Kaplan-Meier 图。

与分级无关，FGFR3是该系列中受影响最频繁的基因。归类为 PUN-LMP 的病例主要显示FGFR3改变 (57%, 4/7) 并且没有TP53突变。此外，在ERCC2、PTEN和PIK3CA中检测到的突变大多是同时发生的，并且总体上不常见 (28.5%, 2/7)。低级别 PUC 病例在 17/20 (85%) 病例中同样表现出频繁的FGFR3突变，11 例病例在PIK3CA (63.6%, 7/11)、STAG2 (54.5%, 6/11) 和ERCC2 (45.4%)中表现出并发改变, 5/11). TP53突变存在于 2/20 (10%) 病例中。HG-PUC 病例显示较低频率的FGFR3改变 (40%, 4/10) 和更多TP53改变 (30%, 3/10)。TP53突变病例总是显示出高TP53组织评分，但相反，并非所有具有高组织评分的病例都表现出TP53基因改变。PTEN突变很少见，但存在于 PUN-LMP 和 HG-PUC 病例中。在所有调查的基因中，只有TP53突变与无复发生存显着相关（p = 0.024，补充图 S1）。

2.5. 整合形态学、免疫表型和突变状态的聚类分析

聚类分析清楚地将非侵入性乳头状尿路上皮肿瘤分为两个不同的亚组。聚类 1 代表 PUN-LMP 和 LG-PUC 病例的混合，显示低增殖率和有丝分裂计数，以及频繁的FGFR3和 STAG2 突变，而聚类 2 包含具有高增殖指数和有丝分裂计数的 HG-PUC，强 CK20 表达, TP53突变但FGFR3 WT (表 4). 聚类分析与临床行为密切相关，并显示与第 1 组（分类为 PUN-LMP 和 LG-PUC 的病例）相比，第 2 组（分类为 HG-PUC 的病例）的无复发生存率较低，( p = 0.029 ,图 3公元前）。使用三个不同的亚组进行额外的聚类分析以确定 PUN-LMP 和 LG-PUC 病例是否可以分开。(图 3B，左侧）。然而，在第 1 组和第 2 组中发现了 PUN-LMP 和 LG-PUC 混合病例，并且该簇与组织学分级无关。几乎所有归类为 HG-PUC 的病例都被收集到第 3 组（图 3B、C，左侧）。

表 4聚类之间蛋白质和突变状态的比较。

免疫组织化学：数据表示为组织评分值的中位数 (p25–p75) 或 (*) 10 HPF 中的有丝分裂数。突变状态由突变病例数 (%) 表示。

Kaplan-Meier 分析显示与集群有很强的相关性，因为第 1 组和第 2 组的无复发生存率始终较高，LG-PUC 和 PUN-LMP 之间存在重叠 (p = 0.055 )。第 3 组始终显示出较高的复发率（图 3C，左面板）。执行比例 Cox 回归模型以估计 RFS 和聚类分析之间的关联。单变量和多变量分析证实临床特征和治疗不影响 RFS。RE-TURB 治疗表示与复发显着相关，但未考虑，因为 RE-TURB 仅在 HG-PUC 病例中进行（补充表 S4）。

多变量分析证实，临床特征和治疗不影响无复发生存，并且复发与由组织学特征、蛋白质表达和突变状态产生的簇组独立相关（补充表 S5 和 S6 ）。

3.讨论

在这项研究中，我们采用了非侵入性乳头状尿路上皮肿瘤的多参数分类，包括突变状态、免疫表型和组织病理学，以试图改进单独组织学分级的风险评估。在之前和我们目前的分析中，乳头状尿路上皮肿瘤的分级具有差到中度的观察者间可重复性。然而，肿瘤的精确分级对于治疗决策和降低复发和侵袭的风险至关重要 [ 2 , 17 ]。分级的差异可能是由于对分级的形态学特征（结构、细胞学、有丝分裂等）赋予不同的权重，尽管多次尝试明确定义分级标准 [18 ]]. 然而，众所周知，分级系统总是涉及一定程度的主观性，影响观察者间的再现性。在乳头状尿路上皮肿瘤中，最困难的挑战是 PUN-LMP 与 LG-PUC 的区别，因为这两种实体都具有典型的乳头状结构，即被尿路上皮覆盖的乳头缺乏顶端有丝分裂活动，唯一的定义特征是存在和上皮异型和紊乱的数量，可以主观评估。在 PUN-LMP 的情况下，尿路上皮看起来更厚，但实际上应该排除非典型性，而在 LG-PUC 的情况下，乳头在低放大倍数下显示出有序的外观，并且存在非典型性但轻微 [ 19 , 20]. 在我们的研究中，与文献一致，PUN-LMP 表现出最低程度的观察者间一致性和可重复性，并且诊断 LG-PUC 而不是 PUN-LMP 的趋势增加。此外，在比较 PUN-LMP 和 LG-PUC 时，复发率的差异相对相似。PUN-LMP 病例的复发率因文献中的研究而异，可能是一种受分类标准影响的结果。PUN-LMP 的复发率为 17% 至 35%，LG-PUC 为 48-71%，HG-PUC 病例的复发率为 78%。相比之下，PUN-LMP 的侵袭风险为 1-3%，LG-PUC 为 5%，HG-PUC 病例高达 45% [ 21 ]。

由于组织学特征表现出明显的局限性，因此研究了其他工具，如有丝分裂计数、增殖率和特异性免疫组织化学标记物的表达，作为对尿路上皮肿瘤进行分级的辅助方法。使用通过半定量方法评估的有丝分裂活性的研究表明，分级的可重复性低，并且与预后的相关性差 [ 18 ]。然而，对乳腺癌的研究表明，可以通过定量方法改善有丝分裂计数 [ 22]]. 在我们的研究中，使用 p-HH3 免疫染色进行有丝分裂计数以减少主观性，尽管必须提到 p-HH3 染色不能直接与 H&E 切片上的有丝分裂计数进行比较。在所有 HG-PUC 病例中均观察到高有丝分裂指数（10 HPF 中 > 20 次有丝分裂），表明 p-HH3 的有丝分裂计数是分级的有用参数。通过 MIB-1 染色评估的增殖率也是一个有用的特征，但 PUN-LMP 和 LG-PUC 之间的增殖率差异细微且重叠，因此无法将其用作分级的唯一参数 [23 ]。一些作者报道了 CK 20 和 p53 染色作为尿路上皮发育不良的客观标志 [ 24]. CK20 通常仅在正常尿路上皮的伞状细胞中表达，而弥漫性全层 CK20 染色是 HG-PUC 的特征 [ 25 ]。然而，在 PUN-LMP 和 LG-PUC 病例中报道了不一致的 CK20 表达；因此，不应单独使用此参数 [ 26 ]。

近年来，强大的高通量测序技术的出现使我们对尿路上皮癌突变情况和特定改变的预后影响的理解取得了重大进展，从而导致了膀胱癌的几种分子分类。据报道，NMIBC 是基因组稳定的肿瘤，其特征是FGFR3突变或染色体易位（在大约 70%的低级别肿瘤中）[ 27、28 ]，这可能导致早期尿路上皮增生 [ 29 ]。与这些数据一致，FGFR3突变是我们系列中最常见的遗传改变（64.1% 的病例）。正如预期的那样，FGFR3突变与非高级表型相关。PIK3CA中的激活突变和粘连蛋白复合物肿瘤抑制基因STAG2中的失活突变似乎在发病机制中起次要作用，因为大多数这些突变与FGFR3改变同时发生[ 30、31、32 ]，正如在大多数本研究中的案例。这表明PIK3CA和STAG2改变本身与低进展风险相关 [ 33 , 34 ]。相反，高级乳头状癌和浸润性肿瘤经常显示TP53的改变、ERCC2和PTEN基因和通路 [ 35、36 ]。很少发现致病性TP53突变，但如果存在，它们仅在 LG- 和 HG-PUC 中被识别，与其他癌症一样，代表恶性肿瘤的遗传特征 [ 37、38 ]。DNA 解旋酶ERCC2，之前被描述为 MIBC 中顺铂治疗敏感性的生物标志物，同样似乎在膀胱癌的发生中发挥作用 [ 39 , 40 ]。然而，正如本系列中所观察到的，它也可以在所有类别的 NMIBC 中识别出来。抑癌基因PTEN与 NMIBC (40%) 相比，在 MIBC (90%) 中大部分基因失活 [ 41 ]。然而，在该系列中，在 PUN-LMP 病例中也发现了失活的PTEN （2/4 病例发生突变）。具有PTEN或TP53突变的罕见 PUN-LMP 和 LG-PUC 病例（通常与高级别肿瘤相关）是否显示出更高的进展风险还有待观察。

在我们的主成分分析中对免疫组织化学和分子标志物的联合评估使我们能够识别出具有显着不同进展风险的两组，尽管病例数量很少。此外，这种使用多个参数的聚类分析表明 PUN-LMP 和 LG-PUC 密切相关，可能代表了一系列生物学行为。鉴于 PUN-LMP 和 LG-PUC 使用相同的临床和治疗方法，目前基于组织学特征并在其解释中具有相当大的主观性的区分的基本原理尚不清楚，需要对更多病例进行进一步分析[ 19 , 21 , 42 , 43]. 采用额外的蛋白质和遗传标记的多参数分析可用于 NMIBC 分级，并可能改善临床行为的预测以及复发和进展的风险。

应该谨慎解释这项研究的结果，因为这项研究只代表了有限数量的患者，其中只分析了有限数量的蛋白质标志物和突变。这项工作主要表示原理研究的证明，其中的主要目标是表明多参数方法具有一些有希望的结果，应该在更大的队列中进行测试。在个性化医疗时代，检测突变或其免疫组织化学替代物的分子组对于选择最佳疗法和预测膀胱癌患者的预后至关重要。由于 PUN-LMP 和 UPC 代表膀胱癌患者临床过程中的早期诊断，因此它们的多参数分析（包括蛋白质生物标志物和突变谱分析）很有希望，应该在更大的队列中进行。

四、材料与方法

4.1. 肿瘤样本

在这项研究中，我们纳入了图宾根大学医院病理学和神经病理学研究所在 2013 年至 2020 年间诊断为非浸润性乳头状尿路上皮肿瘤的所有样本，这些样本符合我们的选择标准：乳头状非肌肉浸润性膀胱癌患者的活检分级作为 PUN-LMP、LG-PUC 或 HG-PUC。选择代表性块进行分析。此外，19 个没有肿瘤或发育异常的膀胱活检样本用作阴性对照。本研究经图宾根大学医学院伦理委员会批准 (547/2021BO2)。

4.2. 根据 2016 年 WHO 分类的组织学分类

为了根据 WHO 2016 年分类进行重新分类，三位病理学家盲目评估了用苏木精和曙红 (HE) 染色的 3 µm 厚切片。病例被分类为 PUN-LMP、非侵入性 LG-PUC 或 HG-PUC。在低、中和高放大倍数（100×、200× 和 400×）下进行细胞学和结构特征的评估[ 8、44]. PUN-LMP 被诊断为具有离散的乳头、细长且未融合的病例，大部分被正常的尿路上皮细胞覆盖，细胞学异型性、有丝分裂和坏死极少或不存在。非侵入性 LG-PUC 活检显示尿路上皮下半部分排列有序的乳头，具有轻度细胞学异型和罕见的有丝分裂。非侵入性 HG-PUC 病例在低倍镜下表现出完全无序的外观，这是由于整个上皮高度的结构紊乱、中度至高度异型和有丝分裂活动 [44 ]。

4.3. 临床数据

审查了医疗记录，包括年龄、性别、疾病表现、位置、范围、TNM 分期、治疗和随访。无复发生存期 (RFS) 是从诊断日期到 5 年或最后一次随访计算的。

4.4. 免疫组织化学

根据制造商的方案，使用自动染色机（Ventana Medical Systems，Tucson，AZ，USA）进行免疫染色。带电载玻片用 CK20 (M7019, Dako Cytomation, Glostrup, Denmark), p16 (06594441001, CINtech, Roche, Manheim, Germany) p21 (556431, BD Pharmigen, San Jose, CA, USA), p53 (DO-7 , Novocastra, Leica Biosystems, Wetzlar, Germany), MIB-1 (M7240, Dako Cytomation, Glostrup, Denmark), p-HH3 (117C826, IMGENEX, San Diego, CA, USA) 和 FGFR3 (sc-13121, Santa Cruz Biotechnology ，德国海德堡）。免疫组织化学使用组织评分进行量化，如下所述。根据强度和细胞百分比对染色进行评分。在膜和细胞质中评估强度并评分为 0：阴性，+：弱，++：中等，+++：强。然后通过将染色强度乘以阳性染色细胞的百分比来计算组织评分。此外，p-HH3 免疫组织化学用于鉴定正在经历有丝分裂的细胞。通过计算 2 mm 中染色细胞的数量来评估染色图 2，使用 Zeiss Axioskop 显微镜（Zeiss，Oberkochen，Deutschland）对尿路上皮的上层进行大约 10 个连续的高倍视野 [HPF]。

4.5. DNA提取

根据制造商的说明，使用 Maxwell ® RSC DNA FFPE 试剂盒和 Maxwell ® RSC 仪器（Promega，美国威斯康星州麦迪逊市）从剩余的活检材料中提取基因组 DNA 。根据制造商的方案，使用 Qubit dsDNA HS 检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）的 Qubit 荧光计对 DNA 进行定量。如先前报道的那样，进行质量控制聚合酶链反应 (PCR) 以确定可扩增的 DNA 长度 [ 45]。选择具有至少 200 bp 可扩增 DNA 的病例进行 NGS 靶向分析。

4.6. 靶向下一代测序

靶向突变分析由下一代测序 (NGS)（Ion GeneStudio S5 prime，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）使用 AmpliSeq Custom Panel 进行，涵盖乳头状非肌肉浸润性尿路上皮膀胱癌中最常见的复发突变基因（完整的编码序列：ERCC2、FGFR3、PIK3CA、PTEN、STAG2和TP53（补充表 S1). 根据制造商的手册使用 Ion AmpliSeq Library Kit v2.0、Ion Library TaqMan Quantitation Kit、Ion 510、Ion 520 和 Ion 530 Kit—Chef 和 Ion 520 Chip Kit 进行扩增子文库制备和半导体测序（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。五例石蜡包埋的乳头状非肌肉浸润性尿路上皮膀胱用于验证 NGS 面板。与人类参考序列相比，非同义体细胞变异的变异调用是使用 Ion Reporter 软件（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）进行的。

4.7. 聚类分析

进行聚类分析以确定具有相似性的患者组。仅对 37 例进行了分析，因为 8 例患者的数据缺失。执行变量标准化 (Versi) 以获得零均值和一标准差。聚类分析基于以下变体：组织学分类（PUN-LMP、LG-PUC 和 HG-PUC）、免疫组织化学（CK20、p53、MIB-1、p16、p21、FGFR3 和 p-HH-3）和突变ERCC2 , FGFR3 , PIK3CA , PTEN , STAG2 , TP53状态（突变与非突变）。K-Medoids 集群的 Partitioning around Medoids (PAM) 算法用于根据患者的相似性对患者进行分组，因为该算法对噪声和异常值不太敏感。在这种方法中，每个集群都由集群中的一个数据点表示。这些点被命名为簇中心点（簇中的对象，其与簇中所有其他成员之间的平均差异最小）。[ 46 , 47 ]。使用欧氏距离计算两个实值向量之间的距离，其定义如下：

4.8. 统计分析

使用 R 软件版本 4.0（R 统计计算基金会，维也纳，奥地利）进行统计分析。使用频率和比例描述分类变量；数值变量报告为均值和标准差 (±SD) 或中位数和四分位距 (IQR)，具体取决于数据的分布。通过研究峰度、偏度和 QQ 图来评估分布的正态性。使用卡方检验评估分类变量。执行 Fleiss 的 Kappa 测试以测量观察者间的变异性。通过 Kaplan-Meier 方法分析无复发生存 (RFS)，并使用对数秩检验来检验组间差异。随访定义为从 24 个月到结果发生或以其他方式删失的时间。使用单变量和多变量 Cox 比例风险回归来评估集群和无复发生存之间的关联。多变量模型的候选风险因素是根据临床考虑和双变量分析的统计学显着结果选择的。执行向后选择以从模型中顺序删除变量。通过矩阵相关检查多重共线性。结果报告为风险比和 95% 置信区间。使用 Schoenfeld 残差评估比例风险假设。所有统计检验都是双侧的，并且 多变量模型的候选风险因素是根据临床考虑和双变量分析的统计学显着结果选择的。执行向后选择以从模型中顺序删除变量。通过矩阵相关检查多重共线性。结果报告为风险比和 95% 置信区间。使用 Schoenfeld 残差评估比例风险假设。所有统计检验都是双侧的，并且 多变量模型的候选风险因素是根据临床考虑和双变量分析的统计学显着结果选择的。执行向后选择以从模型中顺序删除变量。通过矩阵相关检查多重共线性。结果报告为风险比和 95% 置信区间。使用 Schoenfeld 残差评估比例风险假设。所有统计检验都是双侧的，并且p < 0.05 被认为表明具有统计学意义。

5。结论

在过去的几十年中，结合癌症诊断中不同复杂程度的分类已成为肿瘤检测和分层的重要工具。它们与临床行为有很强的相关性，并提供生物学洞察力和对肿瘤的理解，这些肿瘤在可重复分类（如 PUN-LMP）中显示出困难。在这项工作中，我们确认 PUN-LMP 和 LG-PUC 之间的几个组织学、免疫表型和遗传特征显示重叠，也反映在可靠地分离这两个实体的困难上。这最终导致了 PUN-LMP 和 LG-PUC 是否代表生物连续体的问题，组织学分级未能充分捕捉到这一点，需要添加分子和表型特征作为辅助工具以更好地进行风险分层。

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